題目：不同年齡軟骨ECM對BMSC體外和體內(nèi)軟骨生成的影響

（如果需要完整文獻請與我們工作人員聯(lián)系，可試樣）

1. 簡介

基于細胞外基質(zhì)（ECM）的生物材料通過模擬天然微環(huán)境來調(diào)節(jié)沒有外源性生長因子的骨髓間充質(zhì)干細胞（BMSC）的軟骨分化，是軟骨組織工程的有希望的候選者。ECM支架的生物學特性主要取決于原始來源，這將直接影響ECM材料的軟骨作用。盡管近年來對ECM支架的研究不斷擴大，但優(yōu)化的ECM材料在軟骨再生中的選擇較少報道。在這項研究中，我們收獲并比較了新生兒、幼年和成年兔的關節(jié)軟骨ECM。結(jié)果表明，不同年齡ECM在脫細胞前后的機械強度、硫酸化糖胺聚糖和膠原蛋白含量存在顯著差異。因此，三種基于ECM的膠原蛋白水凝膠顯示出不同的組成和機械性能，它們發(fā)揮了年齡依賴性軟骨誘導性。總的來說，體外和體內(nèi)結(jié)果表明，新生兒ECM促進BMSCs的軟骨形成最多，但導致嚴重的基質(zhì)鈣化。相比之下，BMSCs通過成人ECM合成了最少量的軟骨基質(zhì)，鈣化最小。幼年ECM在促進BMSC軟骨生成和預防基質(zhì)鈣化方面取得了總體效果?？傊?，這項研究為我們目前在設計未來基于ECM的生物材料以成功修復關節(jié)軟骨方面的知識提供了重要信息。

2.材料和方法

機械評估

使用納米壓頭確定每個樣品的力學評估（Piuma，Optics11，荷蘭）。有效楊氏模量通過數(shù)據(jù)擬合以下參數(shù)計算得出： 探頭剛度 4.3 （N m?1);半徑 51.0 μm。

機械測試

使用動態(tài)機械分析儀，在室溫下測定膠原蛋白水凝膠和三種不同膠原蛋白-DCP復合水凝膠（Φ 8 mm×h 2.5 mm）的儲存和損耗模量，并在多頻模式（1-5 Hz）下測量其機械性能。

不同年齡兔天然軟骨組織的比較

含水量和機械強度

首先比較了新生、幼年或成年兔的原生軟骨組織的差異。3日齡兔軟骨組織中的含水量（圖1A）顯著高于其他兩個樣品。100天和200天之間的含水量沒有顯著差異。有效楊氏模量測定的力學性能表明，軟骨組織的機械強度隨年齡的增長而增加，各組間差異均有統(tǒng)計學意義。

圖1

表征來自新生兒、幼年或成年兔的天然軟骨組織。（A）含水量（左）和機械強度（中）。（B）DNA，sGAG和總膠原蛋白含量（n = 3）。ns 表示 P > 0.05，* 表示 P < 0.05，** 表示 P < 0.01，*** 表示 P < 0.001。

DNA、sGAG 和總膠原蛋白的定量

通過定量DNA含量來評估新生、幼年或成年兔軟骨組織中的細胞密度（圖1B），其隨著年齡的增長呈下降趨勢。3天樣本的DNA含量明顯較高，為14 371 ng/mg±480 ng/mg，是其他兩個樣本的四倍多。100天樣品中的DNA含量為3325 ±220 ng/mg，高于200天樣品中的2588 ±410 ng/mg，但這種差異沒有統(tǒng)計學意義。3個不同組的sGAG含量遵循相同的DNA趨勢，在3天、100天和200天樣品中分別為184.17±12.30、117.87±2.97和110.57±2.61 μg/mg。3 天樣本中的 sGAG 值在統(tǒng)計學上高于其他兩個樣本，但 100 天和 200 天樣本之間的差異沒有統(tǒng)計學意義。相比之下，3組總膠原蛋白含量的DNA和sGAG值呈逆轉(zhuǎn)趨勢，其中200天樣品的最高值為855.51±38.14 μg/mg，其次是100天樣品中的753.53 ±27.69 μg/mg和3 d樣品中的629.10 ± 19.68 μg/mg。值得注意的是，所有組間總膠原蛋白含量的差異具有統(tǒng)計學意義。

機械性能和降解

通過儲能模量（圖3B）和損耗模量（圖3C）表征了水凝膠的力學性能，它們分別代表了水凝膠的彈性和粘度。一般來說，膠原蛋白水凝膠的儲存量和損耗模量，并且隨著DCP的摻入而增加。此外，隨著老兔的DCPs的加入，復合水凝膠的存儲模量和損耗模量均進一步增加。結(jié)果，四種水凝膠的總儲存和損耗模量遵循膠原蛋白-200d>膠原蛋白-100d>膠原蛋白-3d>膠原蛋白的順序。4種水凝膠在膠原酶溶液中的降解速率如圖.3D所示。一般來說，膠原蛋白水凝膠具有較高的降解速率，在19 h內(nèi)降解。相比之下，3種膠原蛋白-DCP復合水凝膠的降解曲線相似，24 h時膠原蛋白-3d、膠原蛋白-100d和膠原蛋白-200d水凝膠的降解率分別為95.56%、92.20%和93.07%。

討論

當使用天然軟骨組織作為原材料來制造ECM支架時，了解軟骨組織的內(nèi)在特性非常重要，因為這可以為進一步優(yōu)化ECM材料的選擇提供關鍵信息。本研究旨在表征新生、幼年或成年兔的脫細胞軟骨ECM，以及它們在21天體外培養(yǎng)和28天體內(nèi)植入中對BMSCs軟骨分化和軟骨ECM合成的影響。據(jù)我們所知，這是第一項直接比較由不同年齡的軟骨組織制成的ECM支架的研究，以及不同年齡的去細胞化組織的內(nèi)在特性如何影響ECM支架的特性，這進一步影響其軟骨生成性能，以實現(xiàn)成功的軟骨再生。我們的研究提出了幾個值得注意的發(fā)現(xiàn)，即由三種不同年齡的軟骨組織制成的ECM支架的軟骨生成作用。結(jié)果表明，3個不同年齡軟骨組織ECM支架的機械強度、sGAG和總膠原蛋白含量存在統(tǒng)計學差異，影響3個樣品的細胞增殖和分化。詳細的生化和基因分析表明，由較年輕的軟骨組織制成的ECM支架導致BMSCs更好的軟骨形成，但不幸的是，新生兒軟骨組織也會導致不需要的組織鈣化。

首先比較了新生（3天）、幼年（100天）和成年（200天）兔關節(jié)軟骨組織的成分和力學差異。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3天軟骨組織中的DNA和sGAG含量在統(tǒng)計學上高于100天和200天樣品[26，27]。sGAG是帶負電荷的多糖，可結(jié)合并保留水和水溶性分子[28]。因此，樣本的sGAG含量與其含水量相關，在3 d樣品中最高，并隨年齡增長呈下降趨勢[29]。相比之下，關節(jié)軟骨中的總膠原蛋白含量隨兔子年齡的增長而增加[30]。膠原蛋白是軟骨組織中結(jié)構(gòu)的大分子，主要抵抗應激[31]。因此，軟骨組織的總膠原蛋白含量與機械強度一致，并隨年齡增長呈增加趨勢。去細胞化手術有效去除了不同年齡的所有軟骨組織中99%以上的dsDNA，并且dsDNA濃度均低于<50ng/mg干重的臨界脫細胞水平[10]。由于ECM中的sGAG通過弱分子間相互作用（例如非共價鍵）連接到膠原纖維網(wǎng)絡[32]，這在脫細胞過程中很容易中斷。因此，只有25-30%的sGAG在去細胞化后仍留在DCP中。相比之下，脫細胞后所有3個DCP的總膠原蛋白含量幾乎保持不變，表明去細胞化過程不會導致膠原網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)的降解或去除，并保留了軟骨組織的基本結(jié)構(gòu)。這些結(jié)果也與之前的研究一致[9，33]。3種不同年齡軟骨組織的DCPs隨年齡增長呈下降趨勢，總膠原蛋白含量呈上升趨勢。經(jīng)過相同的研磨過程，具有較高機械強度的軟骨組織導致軟骨組織顆粒的晶粒尺寸較大。因此，3 天 DCP 最小，200 天 DCP 的晶粒尺寸最大。雖然大小差異不影響去細胞化的有效性，但它可能會影響DCP上的細胞附著和行為[34]。

3個ECM支架，分別命名為膠原蛋白-3d、膠原蛋白-100d和膠原蛋白-200d水凝膠，由不同年齡的膠原蛋白水凝膠和不同年齡的不同DCP混合制成。SEM圖像表明，膠原蛋白網(wǎng)絡在所有樣品中都保存良好，單個DCP被困在膠原蛋白網(wǎng)絡中。因此，單個膠原蛋白-DCP水凝膠的力學強度受添加DCP的影響，3個水凝膠的儲存和損耗模量遵循膠原蛋白-200d>膠原蛋白-100d>膠原蛋白-3d的順序。當用BMSCs培養(yǎng)時，額外的DCPs在體外也延遲了水凝膠的降解并減少了其收縮，并且在體外和體內(nèi)均顯示出BMSCs的軟骨分化和sGAG合成在體外和體內(nèi)的年齡依賴性性能。膠原蛋白-3d水凝膠實現(xiàn)的軟骨形成最多，其次是膠原蛋白-100d，膠原蛋白-200d最少。這一發(fā)現(xiàn)證實了來自新生兒、幼年或成年兔的ECM支架會導致BMSCs產(chǎn)生不同的軟骨誘導性。這可能是由于許多因素的組合。首先，由于較年輕樣本中的sGAG濃度較高，更多的sGAG能夠在來自年輕兔子的ECM支架中保留。天然軟骨ECM富含GAG，主要由透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素、硫酸皮膚素、硫酸角質(zhì)鹽和硫酸乙酰肝素組成。到目前為止，許多研究已經(jīng)證實了它們在調(diào)節(jié)軟骨形成方面的功能[35]，并且在生物材料中添加GAG可以促進干細胞的軟骨分化。因此，較年輕的DCP中較高的sGAG含量將有利于BMSC的軟骨形成。此外，由于年輕軟骨組織的機械強度較低，來自年輕兔的DCPs晶粒尺寸較小，在膠原蛋白-DCP復合水凝膠中的分散均勻。據(jù)報道，當與BMSC混合時，較小的ECM顆粒可以增強細胞-材料相互作用，并提高軟骨ECM衍生支架的誘導能力[36]。此外，水凝膠的力學性能也影響B(tài)MSCs的軟骨形成。 由于隨著兔齡的增長，DCPs的機械強度增加，膠原蛋白-DCP水凝膠的機械強度也隨之增加。卞等.[37]發(fā)現(xiàn)，與高交聯(lián)結(jié)構(gòu)相比，機械強度較低的低交聯(lián)密度水凝膠更有利于軟骨基質(zhì)的形成。然而，當利用BMSC在體外和體內(nèi)進行軟骨再生時，組織鈣化是一個常見問題[38，39]。 在這項研究中，在膠原蛋白和膠原蛋白-3d樣品中發(fā)現(xiàn)了這個問題，可能是由于不同的原因。膠原蛋白水凝膠在體內(nèi)的組織礦化是由于其快速降解特性導致細胞結(jié)構(gòu)支撐的喪失，因此無法在新組織結(jié)構(gòu)形成之前維持軟骨形成表型[40]。相比之下，膠原蛋白-3d的降解率遠低于膠原蛋白，幾乎與膠原蛋白-100d和膠原蛋白-200d相同。在這種情況下，膠原蛋白-3d誘導的組織鈣化可能是由于其內(nèi)在特性。由于軟骨是骨骼生長的模板。胚胎階段為骨骼發(fā)育[41]，該階段的軟骨ECM也會影響培養(yǎng)細胞的發(fā)育并誘導BMSC的成骨。 因此，源自新生兒ECM的膠原蛋白-3d支架繼承了這一功能并導致再生基質(zhì)的鈣化。相比之下，膠原蛋白-100d和膠原蛋白-200d支架來源于幼年和成人ECM，不再涉及軟骨內(nèi)骨形成過程，也不利于BMSC的成骨分化。在這一發(fā)現(xiàn)的背景下，進一步比較發(fā)育生物學中不同年齡的軟骨組織之間的詳細組成和生物學差異將是有趣的。

結(jié)論

在這項研究中，收獲了來自新生兒、幼年和成年兔的關節(jié)軟骨組織并進行去細胞化。脫細胞前后3個陳年樣品的機械強度、sGAG和膠原蛋白含量差異均有統(tǒng)計學意義。因此，由不同年齡的不同DCP制成的復合水凝膠表現(xiàn)出年齡依賴性軟骨誘導性。一般來說，新生兒DCP促進BMSCs的軟骨形成最多，但導致嚴重的基質(zhì)鈣化。相比之下，幼年和成年DCP的軟骨基質(zhì)產(chǎn)生較少，但沒有觀察到可見的成骨作用?？傊?，它強調(diào)了在軟骨組織工程中使用天然軟骨組織制造ECM支架時年齡差異的重要性。盡管新生兒樣本具有最佳的成骨作用，但它也顯示出明顯的成骨作用，這將是限制其在軟骨再生中應用的關鍵缺點。相比之下，幼年樣本在促進BMSCs軟骨生成和抑制成骨方面取得了總體效果。因此，青少年ECM可能是比新生兒和成人ECM更好的來源。這些發(fā)現(xiàn)為我們目前在設計未來基于ECM的生物材料以成功修復關節(jié)軟骨方面的知識提供了重要信息。

生物組織納米壓痕儀介紹
Piuma納米壓痕儀的核心部件是其安裝在壓痕移動平臺上極其敏銳的壓痕探頭
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從水凝膠到骨組織等，在大氣中或者浸沒在液體中
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在X-Y（12x12mm）范圍內(nèi)測試樣品
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粗進以及精進移動臺實現(xiàn)精確壓痕以及自動尋找樣品表面
5.MANUALSTAGE手動平臺
為任何樣品以及容器創(chuàng)造空間

納米以及微米級別的生物機械性能

Piuma是一個創(chuàng)新的，具有成本效益的工具，用來表征生物材料、組織、細胞器、細胞層、軟骨、靜電支架、力學性能，3D打印材料，水凝膠等的微納米機械性能。

The Piuma 納米壓痕儀專為迎合生物材料以及組織研究人員和工程師的需求，提供易用性和便攜性，同時提供高精度、高通量和多樣化的數(shù)據(jù)。Optics11小型化的玻璃探針式壓頭，特別適合在液體中測量水合樣品。組織工程和再生醫(yī)學的研究者，Piuma納米壓痕儀是衡量他們感興趣材料剛度的一個解決方案。 

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在生物材料、組織工程、再生醫(yī)學和醫(yī)學研究領域，Piuma可以在溶液里進行非破壞性測量測量某點或者某個區(qū)域的楊氏模量、蠕變和松弛實驗，點陣測量粘附力，描述應變硬化行為，樣品的粘度等。測試生物材料和組織樣本的軟硬度可以很容易地在Piuma納米壓痕儀上用其optics11 PIUMA探頭和專用的Piuma軟件來實現(xiàn)。 

Piuma Nanoindenter是荷蘭Optics11公司出品的新型生物納米壓痕儀。主要應用范圍為生物組織、生物支架、水凝膠、聚合物、細胞等軟物質(zhì)以及生物材料的機械性能研究。采用了新型探頭設計，彌補了傳統(tǒng)其他納米壓痕儀無法測試軟物質(zhì)的問題也解決了原子力顯微鏡在軟物質(zhì)測試中的數(shù)據(jù)波動大，操作困難、制樣嚴苛等常見問題。更開創(chuàng)性的在壓痕儀中加入了動態(tài)力學測試模式DMA，可以獲得材料與振動頻率相關的儲存模量、損失模量和損失因子，用于研究材料在交變力作用下的滯后現(xiàn)象和力學損耗。