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致密膠原 （DC） 凝膠促進(jìn)接種牙髓干細(xì)胞 （DPSC） 的成骨細(xì)胞分化，并在體外和皮下與生物活性玻璃顆粒結(jié)合時(shí)經(jīng)歷快速無細(xì)胞礦化。然而，DC生物活性玻璃混合凝膠在將DPSC輸送用于骨質(zhì)部位骨再生的潛力尚未得到研究。在這項(xiàng)研究中，無細(xì)胞和DPSC種子DC-S53P4生物活性玻璃的功效[（53）SiO2-（23）鈉2氧-（20）曹（4）P2O5，wt%]雜交凝膠在臨界大小的小鼠顱骨缺損中進(jìn)行了研究。將骨刺激性生物活性玻璃S53P4摻入DC凝膠中，導(dǎo)致其在體外模擬體液（SBF）中加速無細(xì)胞礦化，其中在1天內(nèi)檢測到羥基碳化磷灰石。到SBF的第7天，微機(jī)械分析顯示礦化凝膠的壓縮模量增加了8倍。 生物活性玻璃對DC-S53P4中的人- DPSC的原位效應(yīng)是顯而易見的，因?yàn)樗鼈冊跊]有成骨補(bǔ)充劑的情況下成骨分化。在成骨培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，堿性磷酸酶和I型膠原蛋白的產(chǎn)生進(jìn)一步增加。DC-S53P4構(gòu)建體的這種骨刺激作用在體內(nèi)得到證實(shí)，植入8周后，無細(xì)胞支架和DPSC接種的DC-S53P4構(gòu)建體均形成礦化和血管化的骨基質(zhì)，具有成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞活性。然而，令人驚訝的是，體內(nèi)顯微CT分析證實(shí)，無細(xì)胞支架產(chǎn)生了更大體積的骨骼，在第3周已經(jīng)可見，并且表現(xiàn)出*的小梁結(jié)構(gòu)。這項(xiàng)研究的結(jié)果表明，DC-S53P4支架否定了干細(xì)胞遞送有效骨組織再生的需要，并可能加速其臨床應(yīng)用。
如前所述，使用大久保的SBF研究了生物活性[31]。將DC和DC-S53P4支架以1：15 （mg/mL）DC/SBF比（即25 mL SBF）置于SBF中，并在6 h、第1、3和7天評估礦化程度，每3天更換一次溶液[10，11]。如上所述，進(jìn)行了掃描電鏡、透射電鏡和XRD分析。在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)使用微尺度機(jī)械測試儀（加拿大，cellscale，MicroSquisher）以100μm / s的壓縮速度對濕水凝膠支架進(jìn)行壓縮機(jī)械測試（n = 5）。
MicroSquisher是一個(gè)微型機(jī)械測試系統(tǒng)，MicroTester細(xì)胞微壓縮可以做別人所不能做之事。更小的標(biāo)本，更好的解像力，更容易的測試設(shè)置和更好的視覺效果。應(yīng)用包括小組織樣品，水凝膠微球，細(xì)胞球體和工程化組織生長基質(zhì)。為了適應(yīng)所有用戶的廣泛應(yīng)用，CellScale推出了兩款MicroTester！
無細(xì)胞和細(xì)胞接種DC-S53P4凝膠支架表面形態(tài)的SEM顯微照片證實(shí)了在纖維膠原基質(zhì)結(jié)構(gòu)中摻入生物活性玻璃顆粒（圖1B）。將S53P4添加到DC表明膠原纖維與生物活性玻璃表面（圖1B，I）和交織的細(xì)胞S53P4和膠原纖維結(jié)構(gòu)（圖1B，II）的結(jié)合。制造的無細(xì)胞直流支架的ATR-FTIR光譜（圖1C）顯示了在1643，1550和1243 cm處通過酰胺I，II和III帶進(jìn)行的特征性膠原蛋白鍵合?1分別為[11，12]。S53P4的光譜顯示硅酸鹽振動的存在，Si-O-Si在1000和1100厘米之間?1;與SiO的非橋接氧鍵?1在 900 厘米?1 [36];和生物活性玻璃內(nèi)的大氣碳酸鹽，位于897和1400厘米處?1 [DC-S53P4支架的光譜顯示了特征性的膠原酰胺I，II和III鍵，而生物活性玻璃的摻入掩蓋了膠原側(cè)鏈在1100-800 cm中的振動?1區(qū)域，而不是顯示 Si-O-Si 和非橋接氧鍵與 SiO?1 [同樣，S53P4光譜中存在的碳酸鹽峰在雜交后再也無法觀察到[11，37]。
在SBF中檢查DC-S53P4雜交凝膠支架的無細(xì)胞生物活性長達(dá)7天。對DC-S53P4的SEM顯微照片的定性研究表明，SBF中礦物的形成水平隨時(shí)間的變化而增加（圖2A）。相比之下，僅DC在SBF的7天內(nèi)顯示出礦物形成的證據(jù)很少（圖。S1）。DC-S53P4 的 ATR-FTIR 光譜（圖 2B）表明 v3 PO 的吸收帶隨時(shí)間變化增加43?在 1022 厘米?1， v4 采購訂單43?在 560 和 600 厘米?1， v2 一氧化碳32?在 873 厘米?1和 v3 一氧化碳32?在 1460 厘米?1以及 v1 PO 的強(qiáng)化43?在 960 厘米?1，均提示HCA在膠原基質(zhì)內(nèi)的形成和生長[38]。此外，S53P4的XRD衍射圖（圖2C）顯示出無定形玻璃的特征圖案，而制造的DC-S53P4在約20°2 θ處表現(xiàn)出寬衍射圖案，這歸因于膠原纖維的隨機(jī)取向[10]。在SBF中6小時(shí)后，這種無定形的寬衍射駝峰變得更小，不那么突出。隨著浸泡時(shí)間的進(jìn)一步延長，從第1天開始觀察到與特征羥基磷灰石有關(guān)的峰（ICDD參考號009-432，圖2D），這在更長的時(shí)間內(nèi)變得更加明顯。峰的增加和變窄不僅表明DC-S53P4支架內(nèi)羥基磷灰石的增加，而且表明支架通過暴露于SBF從無定形結(jié)構(gòu)到晶體結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)變。相比之下，SBF中的直流腳手架（圖1000）。S1）在ATR-FTIR光譜中未顯示表明磷酸鹽含量增加的峰，并且XRD模式僅顯示第7天寬峰色散的輕微指示，類似于在SBF中6 h后DC-S53P4的模式。微機(jī)械壓縮測試表明，在SBF的7天內(nèi)，DC-S53P4的剛度增加了8倍（圖3）。直流與S53P4雜交和SBF時(shí)間（p<0.0001和p<0.01）的壓縮模量均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義增加，而僅直流支架的壓縮模量隨SBF浸泡時(shí)間的增加沒有顯著增加（p>0.05）。
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圖 2.無細(xì)胞DC-S53P4支架在SBF中的礦化進(jìn)展.（A） 在 SBF 中第 （I） 天、第 1 天 （II） 第 3 天和第 （III） 7 天時(shí) DC-S53P4 的掃描電鏡圖像，（IV） 在第 7 天顯示 DC-S53P4 的放大倍率較高。所有比例尺 = 5 μm。（B） 指紋區(qū)域的 ATR-FTIR 光譜，描繪了 DC-S53P4 在 SBF 中 7 天內(nèi)的礦化情況。（C） SBF 中 DC-S53P4 的 XRD 圖譜和 （D） 羥基磷灰石的參考 XRD 圖譜 （ICDD 9–432）。無花果。S1 顯示了超低頻中直流的掃描電鏡、反光柵光譜和 XRD。
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圖 3.通過礦化改變腳手架機(jī)械性能。在 SBF 中 7 天內(nèi) （A） 直流和 （B） DC-S53P4 的代表性壓應(yīng)力-應(yīng)變曲線。（C）直流和DC-S53P4中平均壓縮模量隨時(shí)間的變化在SBF中。根據(jù)學(xué)生 t 檢驗(yàn)，誤差線± SD 和 *p < 0.05、**p < 0.01、***p < 0.001。
為了驗(yàn)證DC-S53P4支架的細(xì)胞反應(yīng)和成骨潛力，在對照和成骨培養(yǎng)基（分別為CM和OGM）中在支架中培養(yǎng)接種的hDPSC長達(dá)28天。在DC-S53P4中接種的hDPSC的代謝活性最初增加后，作為培養(yǎng)時(shí)間的函數(shù)略有減少（圖4A）。在DC中接種并在CM中培養(yǎng)的hDPSC的代謝活性似乎在第7天達(dá)到峰值，隨后隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加而降低。從第14天開始，觀察到在所有條件下培養(yǎng)的細(xì)胞的代謝活性是穩(wěn)定的。第7天的活/死分析證實(shí)CM和OGM中死細(xì)胞的存在最?。?/span>圖4B）。第28天，通過使用Hoechst測定法（圖4C）測量DNA來量化支架內(nèi)的細(xì)胞數(shù)量，每個(gè)支架的細(xì)胞數(shù)量都在150，000至170，000個(gè)細(xì)胞之間，并且在CM和OGM中DC和DC-S53P4之間沒有顯著差異，表明所有支架中的平衡細(xì)胞數(shù)量。
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圖 4.接種的hDPSC在DC和DC-S53P4支架中的代謝活性和活力。（A）接種在（I）DC和（II）DC-S53P4中的hDPSCs的代謝活性，如阿拉瑪藍(lán)®還原測定在對照（CM）和成骨培養(yǎng)基（OGM）中長達(dá)28天所示。（B）在第7天接種在DC-S53P4中的hDPSCs的活/死圖像，分別在（I）CM和（II）OGM中用綠色和紅色熒光指示活細(xì)胞和死細(xì)胞。比例尺 = 200 μm。（D）第28天存在的細(xì)胞數(shù)量，通過CM和OGM的赫希斯特33258 DNA測定進(jìn)行定量。根據(jù)學(xué)生 t 檢驗(yàn)，± SD 和 *p < 0.05、**p < 0.01、***p < 0.001 和無顯著性 （ns） > p 為 0.05。（為了解釋此圖例中對顏色的引用，讀者請參閱本文的網(wǎng)絡(luò)版本。
進(jìn)行組織學(xué)分析以評估DC和DC-S53P4支架的細(xì)胞分散和礦化潛力。Masson的三色在所有條件下都顯示出均勻的細(xì)胞在兩個(gè)基質(zhì)上的分散，而茜素紅和Von Kossa染色表明，無論添加生物活性玻璃，當(dāng)應(yīng)用OGM時(shí)，鈣和磷酸鹽的沉積分別增加（圖5A）。組織學(xué)分析證實(shí)了生物活性玻璃對礦化的影響，其中在無細(xì)胞DC-S53P4支架內(nèi)觀察到輕微的礦化跡象（圖.S3）。
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圖 5.hDPSC種子直流和DC-S53P4支架的礦化和成骨分化。將支架在對照組（CM）和成骨培養(yǎng)基（OGM）中培養(yǎng)，并在第28天使用組織學(xué)分析和蛋白質(zhì)印跡進(jìn)行評估。（A）馬森三色，茜素紅和馮·科薩的組織學(xué)染色。所有比例尺均為 100 μm。（B）ALP，I型膠原蛋白和β肌動蛋白的蛋白質(zhì)印跡（3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)）。（C）ALP和I型膠原蛋白的定量。數(shù)據(jù)以歸一化為β肌動蛋白。根據(jù)學(xué)生 t 檢驗(yàn)，SD 和 *p ±誤差線< 0.05、**p < 0.01。（為了解釋此圖例中對顏色的引用，讀者請參閱本文的網(wǎng)絡(luò)版本。
蛋白質(zhì)分析表明，當(dāng)接種在DC-S53P4中并在OGM中培養(yǎng)時(shí)，細(xì)胞的ALP產(chǎn)量顯著增加（p <0.001）（p <0.001）（圖5B和C）。與所有其他條件相比，雜交DC-S53P4和OGM中hDPSC的培養(yǎng)也導(dǎo)致I型膠原蛋白產(chǎn)量顯著增加（p <0.05）（圖5B和C）。微機(jī)械壓縮試驗(yàn)表明，在OGM培養(yǎng)時(shí)，支架壓縮模量顯著增加（p <0.001），但S53P4的存在沒有顯著影響（p = 0.37）（圖中。S2）。
該研究提出了一種DC-S53P4生物活性玻璃混合水凝膠作為治療臨界大小骨缺損的合適支架。體外調(diào)查證實(shí)了這些DC-S53P4支架的快速礦化和骨刺激性質(zhì)。此外，在植入無細(xì)胞支架和mDPSCs種子構(gòu)建體的臨界尺寸顱面缺陷中，在體內(nèi)觀察到具有組織膠原原纖維和血管網(wǎng)絡(luò)的礦化骨基質(zhì)。然而，新形成的骨的數(shù)量和質(zhì)量在無細(xì)胞DC-S53P4支架中出現(xiàn)較大。雖然骨愈合的機(jī)制尚未確定，但DC-S53P4支架為骨組織工程提供了一種有希望的無細(xì)胞策略。
壓縮、拉伸、彎曲、壓痕和剪切測試的測試模式
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解像力降至10nN
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| MTG2 | MTLT | |
| 外形尺寸 | 56 X 14 X 24cm | 52 X 17 X 21cm |
| 重量 | 9kg | 6.5kg |
| 力度大小 | 500mN | 500mN |
| 可用的力傳感器 | 0.005, 0.02, 0.08, 0.2, 1, 5, 25, 100, 500mN | 0.005, 0.02, 0.08, 0.2, 1, 5, 25, 100, 500mN |
| 力的準(zhǔn)確性 | 約換能器容量的0.2% | 約換能器容量的0.2% |
| 最大夾點(diǎn)分離 | 約10mm | 約10mm |
| 最大速度 | 5mm/s | 5mm/s |
| 最大循環(huán)頻率 | 0.1Hz | 0.1Hz |
| 最大數(shù)據(jù)頻率 | 5Hz | 5Hz |
| Actuator Technology | Piezo-electric Motor | Stepper Motor |
| Actuator Resolution | 0.1um | 1um |
| Range of Field of View | 0.4-11.0mm | 0.8-5.5mm |
| Vertical Image Resolution | 2048px | 1536px |
| Secondary Camera Option | Yes | No |
| Secondary Test Axis Option (Shear) | Yes | No |
